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人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立：（1）探讨肺癌远处转移和阻断其远处转移的研究；（2）模拟晚期非小细胞肺癌转移的自然发生过程；（3）在活体动物的完整器官内评估瘤细胞播散和肿瘤的生长。

实验方法原理         

将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK  IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。

实验材料         

BALB c nu nu裸鼠腺癌细胞株A549

试剂、试剂盒        

小牛血清RPMI-1640培养液pRNAT-U6 Neo磷酸钙即用型SP超敏 感免疫组化染色试剂盒DAB Kit 显色试剂盒甲醛EDTA

仪器、耗材     

荧光显微镜光学显微镜

实验步骤     

一、实验材料准备

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。

2.  肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)，5% CO237℃培养，常规传代。

3.  质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司)，携带Neomycin耐药基因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 μg/ml维持筛选。

二、细胞的转染

1.   哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞，转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。

2.  后培养液内加G418筛选获得稳定转染。

3.  利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。

4.  1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加G418(200 μg/ml)维持筛选。

5.  测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。

6.  待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2×长×宽 计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。

叁、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立

1.  取转染后细胞，用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5×106/0.2 ml备用。

2.  用0.5%的麻醉50 mg/kg)(中国医药上海化学试剂公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26号针头吸取细胞悬液0.2 ml注射入裸鼠左侧胸腔，注射过程中注意控制刺入针头的深度。

3.  整个操作过程在细胞收获后半小时内完成，严格遵循无菌原则。

4.  注射后在KODAK IS2000MM下确认原位种植成功，注射部位为胸腔。

5.  注射后继续饲养，隔天观察一次并记录体重。

6.  当裸鼠出现精神萎靡、呼吸短促、弓背并明显消瘦，体重较注射Et减轻20%时，颈椎脱位术处死裸鼠。

7.  开胸观察，取出器官，用10%甲醛固定保存。

四、检查项目

1.  转染后细胞荧光显微镜成像转染后24～48 h荧光显微镜下观察，确认转染成功。单克隆化过程中镜下观察细胞克隆生长情况。

2.  活体GFP标记成像检测应用KODAK IS2000MM进行活体荧光成像，确认注射部位为胸腔，后间断应用以活体确认瘤细胞的远处转移。

3.  解剖学与组织学检查处死的裸鼠均经

详细解剖学检查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度连续切片，切片严格编号，奇数号行HE染色，光镜观察，以初步确定转移灶。

4.  免疫组织化学染色

选择肺脏、肝脏和脑作为主要研究器官，在HE染色确定转移灶位置的基础上，取相邻偶数号码的切片进行免疫组化检测，CEA鼠抗人单克隆抗体(ZM-0062)，LRP鼠抗人单克隆抗体(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫组化染色试剂盒(sP-9000)、抗原修复液、DAB Kit显色试剂盒(zU一9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

五、统计学处理

细胞的生长活性和肿瘤体积x±s表示，数值的比较采用方差分析。HE检测结果和活体成像检测结果的比较用x2检验。采用SPSSl3．0软件进行统计分析。