细胞实验是上海达为科生物的基础服务项目之一，由细胞平台经验丰富的实验人员操作完成。
一.细胞增殖实验
1. MTT法:是一种检测细胞存活和生长的方法。该方法已广泛于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济、快捷。原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan )并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜( DMSO )能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度值,可间接反 映活细胞数量。在一定细胞数范围内, MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
2. CCK-8法:可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析,常用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。原理:该试剂中含有WST-8 [化学名: 2-(2-甲氧基4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐], 它在电子载体1-甲氧基 -5-甲基吩嗪諭硫酸_二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物( Formazan dye )。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
3. Brdu:即5- Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期, S期活体注射或细胞培养加入。而后利用抗Brdu单克隆抗体ICC染色显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物双重染色可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。但由于抗体分子量大,难于掺入并被有效检测。因此BrdU检测需采用DNA酶或HCI或加热使DNA变性。这些处理方法会破坏抗原识别位点,此外许多细胞周期分析的染料都需要dsDNAD这种处理方法也使得同一样本无法同时进行细胞周期分析。
4. EDU:即5-Ethynyl-2' - deoxyuridine,是-种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期
代替胸腺嘧啶(T )渗入正在复制的DNA分子中。通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性,适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究,尤其适合进行siRNA、miRNA、 小分子化合物及其他药物的筛选实验。
二、细胞凋亡
ANNEXIN V-PI法:在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸( PS )只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸( PS )由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~ 36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之- -。将Annexin V进行荧光素( EGFP、FITC )标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶( Propidium Iodide, PI) 是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞, PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
叁、细胞迁移和侵袭
1. Transwell :是一种侵袭实验技术,其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开,细胞放在低营养的培养液里,为了找吃的,细胞会往高营养的培养液里面跑,但是有膜挡着,所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上- -层基质胶,模仿细胞外基质,于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面,后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。
2.划痕实验:是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线,去除中央部分的细胞,然后继续培养细胞至实验设定的时间(例如72h),取出细胞培养板,观察周边细胞是否生长(修复)至中央划痕区,以此判断细胞是否生长(修复)至中央划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力, 实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别,通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。
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