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详细介绍
一、 细胞凋亡的形态学检测
1、光学显微镜和倒置显微镜
(1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
(2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形
2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡 的进展情况。常用的DNA特异性染料有: HO 33342 (Hoechst 33342) , HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释,终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度-般为10 ug/ml。结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期: I期的细胞核呈波纹状( rippled )或呈折缝样( creased ),部分染色质出现浓缩状态 ; I a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;I b期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小。
3、透射电子显微镜观察
结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡I期( pro-apoptosis nuclei )的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象( cavitations )的空泡结构 ; I a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
二、磷脂酰丝氨酸外翻分析( Annexin V法)
磷脂酰丝氨酸( Phosphatidylserine, PS )正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期, PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一 种分子量为35~ 36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE )或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
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